第十六回 酵母研究における生化学、それにつづくグローバル解析

(投稿:守屋さん@岡山大)

先日の、コロキアム第一回会合(飲み会?)で話題になったことについて今思うことを書いてみます。会合で吉田さんが主張したのは、「Geneticsは嘘をつかない。白黒ははっきりしている。生化学は一方でグレー。」というものでした。生粋のGenetist吉田さんらしい意見だと思います。このエントリーでは、(現代の)酵母研究者にとっての生化学と関連するグローバル解析について考えてみたいと思います。だらだらとした長文であることをお許しください。

前のエントリーでも書いたかもしれませんが、日本の酵母研究の父の一人である大嶋先生は、「酵母がもつ(他の生物にはない)強みは遺伝学である。」とおっしゃいました。私もこれに反対するつもりは全くありません。Yeast2012に参加していても(この学会がGenetic Society of America主催であることはさておき)、他の生物の追随を許さない強力なGeneticsの力、現在はGenomicsがこれに加わっていますが、を見せつけられます。

強みがあるのだからこれをとにかく使う、というのは当然の戦略です。ただ、私はGeneticsに頼りすぎて、実はそんなに難しくないBiochemistryから酵母研究者が遠ざかりすぎているのではないかという懸念も感じます。私は十数年前に、いまはなき三菱化学生命研でポスドクをやったのですが、その面接でGeneticsの学位論文の仕事を発表したときに、当時の所長だった永井克孝先生に、「Geneticsは点、Biochemistryは(その点をつなぐ線)」だと言われました。

そのせいではないのですが、生命研での仕事は、未知のプロテインキナーゼを、活性をたよりに酵母から精製するというものでした。そのとき当時のボスの酒井明さんが引用されていたのは、2003年になくなられたIra Herskowitz氏が学会で言われた(らしい)「これからは酵母研究者は生化学をしなければならない。」という言葉でした。私は一年かけて酵母の細胞抽出液からカラムクロマトグラフィーをやってキナーゼを同定しました。もちろん、このキナーゼ存在はその前のGeneticsがなければ予想できないものであり、キナーゼ活性のアッセイ系もGeneticsから得られた情報から構築されたものでした。まさにGeneticsで点をうち、Biochemistryで線を繋げたという感じです。

けれど私がやったこのBiochemistryは、ほんとうに酵母の強みをいかせるものだったのか?

その答えが私がキナーゼを精製した一年後に明らかになりました。こないだの会合では「Crappy Collection」といっていましたが、Eric Phizickyのグループが酵母のGenetics(Genomics)とBiochemistryをつなぎました。すべての遺伝子をプラスミドにつなぎ、それぞれに精製用のタグであるGSTをつけたのです[1]。これでGSTで精製したタンパク質の活性を測り、そのタンパク質を発現する遺伝子を持ったプラスミドをたどるだけで遺伝子が同定できます。私はのちに、留学先で同様のMike Snyderのグループが作ったCollection [2]を使って、わずか2回のアッセイで上記のキナーゼともう1つのキナーゼにたどり着いたときには愕然としたものです。

こういう便利なツールができたことは、酵母の強みをさらに高めましたが、ゴリゴリの生化学からは酵母研究者を遠ざけてしまったとおもいます。まあそれはそれでいいのでしょうけど。

一番はじめの話題に戻りますが、酵母の研究者がやる「Biochemistry」は、in vitro酵素活性測定はほとんどやらず、プルダウンなどの相互作用が中心です。これはグレーかもしれません。しかし私は、酵素活性を伴うBiochemistryは、それこそ決定的・とどめとなるデータだと思います。だからもっと活性測定をやりましょうということになるのですが、活性測定ができるタンパク質がターゲットでない場合には難しいですね。

なんだかまとまらないエントリーになっていますが、最後にもう1つだけ。こないだの会合で、Snyder氏の仕事に対して再現性の点で疑問が差し挟まれていました。ただ私の意見としては、GST-fusion collectionにもみられるように、Functional Genomicsの歴史を開いた彼の功績は大きいと思います。彼のグローバル解析に対する評価は、会合でさらに話題になったように、グローバル解析はどれくらい「完全」なのか(例えばノックアウトコレクションには何%間違いがあるのか)ということと関係が深いように思います。これは「ゲノム解析の塩基配列決定のミスがかつてどれくらい許されたのか」、という歴史に近いようにも思います。

今日の谷内江さんのすばらしいトークにもありましたが、CompleteなFunctional Genomicsというのはあり得るでしょうか?今ちょうどトロントのグループのトークでもやっていますが、「そのグローバル解析は、スクリーニングのために行われているのか、完全なランドスケープをみるために行われているのか?」。得られた個別のデータをどこまで信じていいのか。そういうことを評価する軸が必要なのかもしれません。例えば、これまでに既に知られているインタラクションが「得られなかった率」はどれくらいなのか、という評価です。

この評価は、グローバル解析をやる方にとっては恐怖であり、コストも大幅にアップするのでさけたいでしょう。したがって、この評価は、あくまでそのデータやリソースを使う側がそれをどれくらいの信頼度で使うかという「指標」として冷静に用いるべきでしょう。グローバル解析のために作られたデータやリソースは、作った側としてはもうけ度外視で提供しているものです。作った側としては、「Crappy Collection」などとは呼ばれなくないでしょう。最後はNBRP-yeastにgTOWコレクションを提供している立場としての言い訳っぽくなってしまいました。

[1] PMID: 10550052
[2] PMID: 11474067

投稿日: 2012年8月4日 | カテゴリー: 酵母研究エッセイ, Uncategorized | パーマリンク 7件のコメント.

  1. 谷内江@トロント大です。

    守屋さん、熱いご意見をありがとうございます。

    「遺伝学は白黒つけるのが得意で、生化学はグレーかどうか」私はたとえそうであっても遺伝学も生化学も重要なアプローチだと思います。

    私たちのサイエンスの営みは(十分にhumbleになれば)仮説の「証明」ではなく、仮説を補強するデータの積み上げです。
    これは私のようなテクノロジー開発の分野であっても基本的にかわりません。
    (テクノロジーもサイエンスも仮説とそれを補強するデータの積重ねをよりどこりにします。)
    そしてどこまでその仮説を積み上げるかは私たちの匙加減です。

    ここで、私がある仮説を補強したくて「満足」できるだけのデータを100点だとしましょう。
    例えば遺伝学が98点までを「満足」させたとしてもあとの2点を生化学が埋めなくてはいけないことはあるでしょう。
    遺伝学だけで100点を埋める事もあるでしょう。
    もしかしたら吉田さんのように遺伝学者の「満足」の基準では生化学だけで100点をとることはできないのかもしれません(それには私は同意できます)。
    一方で守屋さんの仰るように仮説を「満足」させられない10点、2点を生化学が最後の一手として埋めるだろうことも十分に理解できます。

    もし遺伝学こそが私たちの「満足」の基準を超えてなにかを「完全に証明」するのだという考え方があれば、それには同意できません。

    グローバルスクリーニングはいろいろ考えることがありますが、一つだけ言わせて下さい。

    会合で話題にあげましたが、日本人の大規模実験の精度やコンストラクトは本当に信頼されています。
    諸処で10%のエラーが当然の世界で日本人が似たようなことをすると1%程度のエラーしかないというような話は耳にします(例えばアメリカの研究者から理研の吉田稔先生のラボの名前があがったことがあります)。
    私はこのような話を聞くたびに日本人であることを誇りに思い、一緒に働いてくれるテクニシャン達に「あなたのQuality Controlや美しさを求めた戦略は度が過ぎる」と言われようとも、こだわりをもった町工場のように信念に沿って仕事をしようと思います。

    統計の世界では「たった1%のエラー」であっても、生物学の世界では大規模実験の1%エラーが往々にして重要な遺伝子やパスウェイに落ちることがあり、それを遺伝学者が個別に詳細に調べると再現できないことはよくありそうです。

    私はこのことに対して大規模実験の側に立って擁護する議論を広げることもできますが、このことに対しても常にhumbleでありたいと思っています。

    時間をかけて刀を美しく研ぎすまし、精神集中し、サムライのようにずばっと切るような仕事がしたいです。

    なんだか言ってることがわけがわからなくなってきたのでこの辺にします。

  2. はじめまして。ブルックリン大学のAmyと申します。先日、プリンス大学でのYeast Genetics Meetingに於いて酵母コロキアム第一回会合に参加させていただきました。みなさんの酵母へ対する熱意がハイレベルなDiscussionから伝わってきました。

    さて今回の本題です。まずGenetics and Biochemistry。Fred Cross研究室出身者の私として、吉田さんの言われるGeneticsは嘘をつかないBiochemistryはグレーについて自分なりの意見を書いてみます。それぞれの実験系の特徴を個々に考察したときにはやはりGeneticsの結果は強いと思います。そしてBiochemistryは他のin vivoの裏付けがない限りあくまでin vitroの結果であり、それ自身ではグレーであることが言えると思います。GeneticsならCleanな結果が出ていればそれだけで結論に結びつけることが出来うる強みがあると思います。Geneticsの裏付けの後に最後にBiochemistryで決めるというスタイルなら、弱い遺伝学的結果をサポートできるでしょう。つまりはvivoが大切だということです。Geneticsは究極のvivo実験。それから酵母研究者が生化学を敬遠しているというのは事実だと思います。簡単な生化学でも、なかなか手が出せないのが現状ですが、生化学なしで論文が通らないことが多いので、自分自身でも克服していきたい領域ではあります。皆様と意見が一致していると考えていいでしょうか。

    次はknockout collectionについて。私がポスドクを始めた2003年にcollectionを買ってSynthetic Genetic Array (SGA)の実験のセットをしました。もちろんある程度のエラーがあることは想定内でしたが、PCRで確認したところ20%という数字でした。これには少々驚いて某会社に電話し説明しましたが、この会社はこのerror rateについて全く知らなかったようなのです。商品を営利目的で販売するのであれば、その商品がどういうものなのか知っておくのが当たり前であるし、この会社と数回のやりとりを行いました。結局、彼らのウェブサイトでエラーについては責任持ちませんという文章を載せるということになり、今では明記されています。さてこの20%のエラーを念頭においてSGA screeningするとします。False positiveの多いこの系では50%くらいの結果が(どれくらいpositiveの定義を厳しくするかによります)Junkということになります。これにもともとのcollectionのエラーを考慮すると発表されているSGAの結果の40%だけが真実であることになります。問題なのはほとんどの論文で結果を古典的な遺伝学で確認していないこと。これらの結果がSGDやBioGridでひっかかってきます。なので、あくまでも我々がGenetic interactionの結果を見る時にこのことを念頭におかなければなりません。個々の遺伝的関係ではなく、あくまで全体として結果を捉えなければなりません。

    そして最後に私もアメリカに来てからサムライスピリッツで実験していることに間違いありません。

    • KO collectionを扱っているのはOpenBiosystemsだと思いますが、「エラーについて責任が持てない」という記述は必要ではあると思いますが、正直あの価格でQuality Controlまで期待するのは酷です。そこまで期待すると価格は多分10倍にはなるでしょう。あるいは取り扱いをやめてしまう可能性すらあります。

      pombeのコレクションなんてcerevisiaeよりずっと価格が高い割にはエラー率がずっと高いですよ。他の人の意見を聞きたいですが、私はあそこから個別の遺伝子破壊株を購入する気になれなくなりました。

      恐らく私たちcommunityとしてすべき事は、エラー率をそれこそ自分のウェブページ等でオープンにし、どの部分が間違っているかをcommunityでdiscussionする事ではないかと思います。それこそ、この場なんてのはそれに利用するにはもってこいだと思いますね。

      pombeの破壊株についてはこんなページもあります。
      http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/Bioneer.html

      手前味噌ですが、私が以前発表した論文ではSanta Cruzの抗体の評価をやっていて、吉田さんとか大西さんには、ちょっとほめて(?)もらいました。

  3. 丑丸敬史

    丑丸@静大です。

    上記の件、酵母研究者は確かにどれだけクレバーにトリッキーな系を用いて新しいことを発見するかに情熱を傾けていると思います。このこと自体はとてもいいと思います。

    ただ、泥臭いことを敬遠していることも確かで、細胞成分から活性を頼りにタンパク質を精製する、というような仕事が現在ほとんど見られないのは残念です。

    しかし現実をみれば、

    geneticsはクリアカットな結果をもたらす。
    geneticsから攻めた方が真実に辿りつきやすい(論文は速くだせる)。

    上記のメリットがある限り、酵母研究者はgenetics至上主義にならざるを得ません。

    一方、geneticsでモデルを構築できたら、vitroの出番です。
    vivoとvitroは細胞生物学の両輪です。
    そつのない論文を出したければ、vitroの実験は重要です。
    私もリン酸化/脱リン酸化の研究をしていますが、キナーゼと基質と思われるものを見つけてin vivoでリン酸化状態に差があっても、直接か間接かはvitroでポジティブにならないとなんとも言えません(ただし、vitroはそのような活性があるということが示せるだけなので、vitroでポジでもやはり証明したことになりません。この辺の議論になると、何をどう示そうとも細胞内で起こっているイベントの完全証明は困難です)。

    隣の研究室にいる先生は生化学の方でvitroに軸足を置いていますが、細胞生物学にとっては、vivo > vitroであるべきと思います。取り出したタンパク質や酵素にどんな活性があったとしても、細胞中でそれがそのように働いているという証拠にはなりません。

    >Amyさん

    そのKOコレクションはOpen Biosystemsのものですか?
    由々しき問題ですね。
    うちは、EUROSCARFから購入しましたが、大丈夫でしょうか心配です。
    一つ間違いは見つけましたが、総体ではどうなのか??

  4. 皆さん、学会お疲れさまでした。谷内江さんの「サムライ・スピリッツ」と似た話を昔先輩から聞かされたことがあります。先輩の先生だったかご親族だったか、女性のシニア研究者から言われた事らしいのですが、「理学部の男はナイフの切れ味、農学部の男は鉈の切れ味。」だそうです。これ、谷内江さんのおっしゃる日本と米国(?)の研究姿勢の比較にも似ていませんか?細かい所をさくさく切るか、おおざっぱだがドカッと切り開くか。日本人が繊細な仕事をする事はほめられるべきですが、細かくならないように気をつけたいですね。

    ですから谷内江さんのおっしゃるように、「日本刀」の切れ味を持ちましょうという事なのでしょう。

  5. ちなみに私はInvitrogenの時代に買いました。Euroscarfは10-15%くらいのエラーですので、こちらのcollectionの方が優秀です。ただ、Euroscarfは確かコロニーの状態で来るので自分で冷凍保存しなければなりません。この過程で注意を払わなければcross contaminationすることになります。多くのエラーはcross contaminationによって生き残る力の強いdeletion strainがdominantになってしまうためだと思われます。

  6. 丑丸敬史

    Amyさん、情報ありがとうございました。

    うしまる

コメントを残す

以下に詳細を記入するか、アイコンをクリックしてログインしてください。

WordPress.com ロゴ

WordPress.com アカウントを使ってコメントしています。 ログアウト /  変更 )

Google+ フォト

Google+ アカウントを使ってコメントしています。 ログアウト /  変更 )

Twitter 画像

Twitter アカウントを使ってコメントしています。 ログアウト /  変更 )

Facebook の写真

Facebook アカウントを使ってコメントしています。 ログアウト /  変更 )

%s と連携中

%d人のブロガーが「いいね」をつけました。