第八回 プラズモダクション

トロント大学の谷内江です。

今日のトロントは氷点下5度でした。年が明けたら氷点下20度まで下がります。

守屋さんが話題提供して下さった「第三回 酵母の形質転換効率」の議論の中で、酵母の形質転換に関してその効率や、細胞質に取込まれたDNAが核内へどのように移行するのか、プラスミドの導入が難しい株などについて話題になっていました。

これらに関連して今回はプラズモダクションによる形質転換について書いてみたいと思います。

酵母の形質転換は一般的にリチウムアセテイト法、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法が用いられますが、これらの方法はいずれも酵母のコンピテント細胞の作成が必要で、手間の割に高い効率が得られません。スフェロプラスト法で数%程度でしょうか。

ライブラリースケールの形質転換でよく用いられるのはリチウムアセテイト法ですが、一般的に96ウェルのプレートを用いるなど反応のスケールが小さくなります。私が簡便でライブラリースケールの形質転換によいと思うのはZymoresearch社のEZ transformation kit(リチウムアセテイト法)[1] ですが、株によっては上手くプラスミドの導入ができず形質転換効率は常に問題になります。

システマティックなスクリーニング技術の発展とともに、ある特定のプラスミドをいろんな遺伝的バックグラウンドをもった株群にライブラリースケールで導入したいという要求は増えてきました。守屋さんが最近発表されたgTOWの仕事(2D gTOW)[2] にもそういった要求がありそうです。

そこで便利なのがコロンビア大学のRodney Rothsteinらが2002年にMethods in Enzymologyに書いたプラズモダクション(plasmoduction = plasmid + induction)です [3]。

プラズモダクションは交配と紡錘体極体(spindle pole body)の複製に関わるKAR1という遺伝子のアレルkar1∆15を利用します(KAR1のbiologyは吉田さんが詳しいでしょうか)。

kar1∆15の一倍体株は交配によって二倍体を形成することができますが、核を融合させることができません。つまり交配によってできた二倍体には一倍体由来の二つの核が存在することになります。

[条件]と[手法]はシンプルです。

[条件]

形質転換のターゲットとなる「レシピエント」の株はcycloheximideやcanavanineに非感受性のアレル(can1^Rcyh2^R)をもつ必要があり、もちろんプラスミド導入のためのマーカー遺伝子が利用できる遺伝型である必要があります。

[手法]

1) 「ドナー」としてkar1∆15であり、cycloheximideやcanavanineに感受性を示す(CAN1^SCYH^S)株を準備します。

2) 「ドナー」株に目的のプラスミドを形質転換します。

3) 「ドナー」と「レシピエント」を交配させます。二倍体では細胞質は混ざりますが、一倍体由来の二つの核は融合しません。

4) ここでプラスミド上にあるマーカーとcycloheximideやcanavanineで細胞を選択します。

このようにして細胞質を経由して移ってきたプラスミドを選択しながら「ドナー」由来の核自体の脱落を誘い、「レシピエント」由来の核「だけ」とプラスミドをもった株が選択できます。

酵母の高い交配効率によって高い形質転換効率を得ることができます。

kar1∆15アレルを利用することで「ドナー」と「レシピエント」の染色体がぐちゃぐちゃに混ざることもありません。

一旦「ドナー」株を作ってしまえばどんどん色んな株にプラスミドを導入できます。対象株群のコンピテント細胞を一つ一つ作る手間も必要ありません。YPDを用いて1:1で「ドナー」と「レシピエント」を96ウェルプレート内で混ぜて、プレートを遠心し、数時間インキュベートして選択にかけるだけという流れになるでしょうか。

コンピテント細胞を作る手法で形質転換が上手くいかない場合によいかもしれません。ラボに一株、プラズモダクション「ドナー」株があると便利そうです。

懸念されるべきは「レシピエント」側に交配関連遺伝子の欠損があった場合は上手くいかないかもしれないという点です。

私が疑問に思った点は、「ドナー」の核から「レシピエント」の核にそんなに簡単にプラスミドが移行するのかという点です。小さな(?)プラスミドは高い確率で核から出たり入ったりしているのでしょうか?

また、核が融合しない性質は、ある特定の細胞由来の核を別の細胞の任意の細胞質形質と同時に選択するのに役立つかもしれません。

前回の「第七回 酵母はなぜ胞子を作るのか」での議論に戻りますが、古い細胞のprotein fociを蛍光マーカーとプローサイトメトリーで選択しながら若い細胞の核とアッセイすることができるでしょうか?

 

[1] http://www.zymoresearch.com/product/frozen-ez-yeast-transformation-ii-kit-t2001

[2] Moriya H, Chino A, Kapuy O, Csikász-Nagy A, Novák B (2011) Overexpression limits of fission yeast cell-cycle regulators in vivo and in silico. Mol Syst Biol 7, 556

[3] Georgieva B, Rothstein R (2002) kar-mediated plasmid transfer between yeast strains, an alternative to traditional transformation methods. Methods in Enzymology 350, 278-289

投稿日: 2011年12月11日 | カテゴリー: 遺伝子工学 | パーマリンク 19件のコメント.

  1. 守屋@岡山大学

    この方法、Amon氏らのグループがDisomy株を作った時(下記文献)に用いられています。ですからプラスミドだけじゃなくて染色体もトランスファーされる方法なはずです。

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17702937

    ただ、私には、Supplementaryに書かれている方法を読んでも今ひとつ理解できません。なぜこの方法が選ばれたのか、選択のロジックとか。

    プラズモダクションが報告されてから10年近くなる訳ですが、あまり広がらないのには何か理由があったりしないでしょうか(それを議論できるのがこの「場」だと思います)。

    染色体一本丸ごと動かして(作りにくい)Disomyを作るのにはこの方法が優れていたという事なんでしょうね。染色体一本を酵母細胞の外で扱うのがとても難しいからでしょうか。

  2. 谷内江@トロント大です。

    守屋さんありがとうございます。プラズモダクションでは染色体も確率的にトランスファーされてしまうはずですが、問題は効率です。プラスミドにポジティブセレクションをかけて、染色体にはかけなければ、殆どの場合は染色体のトランスファーなく核自体が脱落するといのがトリックだと思います。

    AmonラボのAneploidyを作る方法は染色体自体にポジティブセレクションをかけています。これはクロモダクション(chromoduction = chromosome + induction)です。

    私にはこの方法はAneploidy株を作る際に合理的に見えます。核が融合してしまうと、一つの核に二本ずつ染色体が入ってしまう(diploidができる)ので、ある任意のchromosomeを二つにしたいときはこの方法がよいのではないでしょうか?他に任意のchromosomeを二つにする方法はありますでしょうか?

    プラズモダクションは任意のプラスミドを(遺伝的バックグラウンドの異なる)大量の株に放り込んでアッセイしたいときに “はじめて” 役立つ、というのが広がりを見せていない理由でないでしょうか?これからシステマティックで大規模なアッセイが発展を見せるなかで有用なのかもしれないと思い議題に挙げてみました。

    どなたか経験のある方いらっしゃいますでしょうか?

  3. 谷内江@トロント大です。

    追補です。

    いずれにしても “核間” のDNA分子のジャンプ効率が肝かとおもいますが(染色体分子のジャンプは極めて少ないのがプラズモダクションの前提)、これがDNA分子のサイズ依存なのか、ご存知の方いらっしゃいますでしょうか?

  4. 吉田です。

    プラスミドは小さいしコピー数も多いので細胞質から核へと移行するのも納得できます。普段の形質転換時にもこのようなことが起こっているはずですよね。

    ただkar1細胞で染色体まで他の核にトランスファーできうるというのは予想外で小胞輸送のように核膜自体が融合することも低頻度でおこりうるのかもしれませんね。脂質の合成を調節して核膜の流動性を変化させることで染色体移行の確率を高めることが可能かもしれません。

    私は細胞質分裂の変異体やスピンドル配向の変異体で多核になるのをよく見るのですが、それらの核が再融合するのは顕微鏡レベルではみたことがありません。動物細胞の場合次のmitosisで核膜が消失するので巨大な一つの核に再編されるのしょうが酵母の場合核膜が崩壊しないので2核-4核-8核と増えて行ってやがて分裂停止してしまいます。

    細胞分裂失敗=多核になる=polyploidy=chromosome instabilityという議論を酵母の論文でも良くみかけるのですが
    (例えばhttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867408011963)
    多核=polyploidyという議論は酵母ではすこし乱暴な気がしています。

  5. 谷内江です。

    エンドサイトーシス関連にdefectがあると形質転換効率がよくないという話がでていましたが、実は小胞輸送が結構効いてるのでしょうか?

    matingでは核はどういうメカニズムで融合するのですか?

  6. 大西(スタンフォード)です。

    プラズモダクション、もしかしてSGA法と異なる方法で二重変異株コレクションを作成するのに使えませんでしょうか。ちょっと乱暴ですが、思いついた方法です。

    (1)ドナー株に、[LoxP]-[2 micron-URA3]-[LoxP]の形でARS、[SceI]-[5’UTR-selectable marker-3’UTR]-[SceI]の形で遺伝子破壊カセットをもったプラスミドを入れ、全非必須遺伝子についてコレクションを作成。さらに、GAL-Cre, GAL-SceIを持った別のプラスミドを入れておく。

    (2)プラズモダクションで上記二種類のプラスミドを、yfg-delta株にトランスファー

    (3)CreとSceIを発現誘導。プラスミドからARS(と同時にURA3)が失われ、さらにSceIで破壊カセットが切り出される。
    selectable marker positive, 5FOA insensitiveな細胞を選択する。

    どうでしょうか。思いつきなので、なにか落とし穴があるかもしれません。

    homologous recombinationを介しているので、遺伝子破壊に確信を持てないのが一番の問題でしょうか。homologous regionはかなり長くなるように設計できるので、効率は高くできそうですが。

    逆にアドバンテージとしては、胞子形成を介さないので時間がかからない、小規模なラボでもやりやすい、選択マーカーを持たない、ts株や表現型の弱い(もしくは表現型のでない)変異株をrecipientとして使える、というあたりが考えられます。

  7. 谷内江さん、

    mating時には核膜に埋め込まれているSPB同士が(Kar1はSPB構成因子です)融合することで核全体の融合がおこります。クロモダクション時に核の一部だけが融合/分離をしているとしたらおもしろいですね。かなりの程頻度でしかおこらないのでしょうが。
    核膜孔のサイズを考えると裸のDNAならともかくクロマチン構造をとった染色体が通過することは物理的に不可能だと思います。

    大西さん、

    おもしろいアイデアですね。2重破壊株の選択にネガティブセレクションも加えているのが素晴らしいと思います。

  8. 吉田さん、

    なぜmating時だけにSPB同士が融合するのでしょう?何かの遺伝子のスイッチをONにして多核になった細胞の核を融合させることは可能ですか?

    大西さん、

    私ちょっとわかりませんでした。基本的な対照として考えられるのは、

    [5’UTR-selectable marker-3’UTR]、URA3をもったプラスミドをプラズモダクションで形質転換し、selectable markerで組み換えを、5-FOAでプラスミドの脱落を選択する方法でしょうか。

    (1) SceIでのカセットの切り出しは組み換え効率に効きますか?ゲノム側も切らないとend-repair recombinationにならない?

    (2) loxPはURA3プラスミドの脱落効率に効きますか? high-copyでない場合はloxPがなくても結構脱落するように思います。

    (3) SceIでのURA3 defectを狙うという手もありそうです。URA3pr-[SceI]-URA3とかにして、プロモーターと遺伝子の間を切るとか。

    (4) loxPを使う場合でも、CreとSceIともに同じプラスミドにいては駄目でしょうか?

    関係ありませんが、私は最近ある目的のためにURA3と5-FOAを使って以下のようなことをしています:
    loxP-URA3-lox2227をもった株を作る(バックボーン株)。
    (loxPとlox2272は組み変わりません。lox2272はbrainbow論文のものを使いました。)
    loxP-[ランダムな配列]-[選択マーカー]-lox2227、URA3、GAL1pr-CreをもったプラスミドをLiAc法で放り込む。
    ガラクトースでCreを誘導後URA3を5-FOAでcounter selectする(選択マーカーも念のため使う)。
    こうすることによって高効率でloxP-[ランダムな配列]-[選択マーカー]-lox2227をゲノムにコードした株が沢山作れました(>1,000,000株)。
    これをどう使うのかはまたいつかお話させて下さい。

  9. 追補です。[ランダムな配列]とは任意のランダムな配列ではなく、ランダムな配列の集団です。最終的には異なるランダム配列をもつ株が沢山できるという意味でした。

  10. プラズモダクション、一般的な形質転換とは違うロジックで考える必要がありますね。だからこそ今までの考え方では想像できなかった「思わぬこと」ができそうな気がします。

    メカニズムも不思議ですね。まあ通常の形質転換もよくわかってない部分がありながら成功している訳ですから、まだまだ細胞がやる事には未知の事がたくさんあるという事ですね。

    大西さんのご意見に対して、すこし違う方向からのコメントをさせてください。

    今や合成致死と言えば、トロントBooneとAndrewsの十八番となっています。私は、「もう彼らに全部お任せしてしまえばよい」と思っていて、そこに手を付けようとは思わないのですが、これから私たちが自身でやるメリットありますかね?

    自分の見たいプロセスがあって、その合成致死の解析がトロントにやられていなければやる価値があるのかもしれません。でもそれよりはトロントに頼むか解析が終るのを待つか・・・。あるいはそもそも合成致死スクリーニングで分からなきゃいけないことがあるのか・・・。まあそんな事、何も考えずにやってしまえば良いという考えもあるでしょう。

    進め方の自由も許されているのがサイエンスだとは思いますが・・・すみません意見まとまらなくて。

  11. 谷内江@トロントです。

    トロントの合成致死はそれを増産するロボットも政治も巨大です。
    一方でデータの”質”は悪いです。やっている本人達もわかっています。だからCostanzo et al (2010) Scienceでもネットワークは合成致死のネットワークでなく合成致死プロファイルの相関ネットワークになっているのでしょう。

    私は日本のトヨタや日産がフォードのような巨大会社と競り合う(勝つ)までに成長したように、ビッグデータの分野にいながらも、常にあせらず、日本人らしいきめ細やかさを実験の見えないところにまでちりばめ、日本人らしい美しい強さで戦える人材になりたいと思っています。

    日本を離れてアメリカ、カナダのすばらしいサイエンスと文化にふれながら、そう思うようになりました。サイエンスを楽しみながら、私のモチベーションの少なくない割合をこういう考え方が支えています。

  12. 大西@スタンフォードです。

    守屋先生のコメントに対して私なりに考えた答えです。
    (書いている間に谷内江さんのコメントが入りましたが、そのまま投稿します)

    トロントにすべて牛耳られてしまうのは癪にさわる、というのは置いておいて(谷内江さんすみません)、おっしゃる通り、既に見られている非必須遺伝子の破壊株や必須遺伝子のts株については、これからやる意義は無いかもしれません。

    一方で、酵母研究フィールドの資産として、大量の点変異株が既に存在し、その数はどんどん増えています。
    例えば、わたしはPringle研究室に居ますが、彼が30年以上前にHartwellと行ったcdc変異株は未だに大量に冷凍庫に凍っています。このうち、未解析なものもたくさんありますし、同じ遺伝子の変異でも、アレルによって表現型が違うことは非常に多いです。

    個人的に、genome-wideにgenetic interactionを見てみたい変異株は山ほどありますが、なにせアウトプットが読めないので、トロントに依頼してやってもらうのはハードルが高いです。

    今回考えたような方法で、小さなラボでも、研究者が思い入れのある遺伝子に付いて解析できるようになる意義はあるように思います。

    たとえば、とある蛋白質が一カ所でリン酸化されていることを見いだしたとします。そのリン酸かサイトの変異株を作って表現型を見たけど何も出ない、思いつく遺伝子と二重変異にしても何も出ないとします。現状だと、さすがにトロントに依頼するわけには行きませんので、ここであきらめますよね。しかし、もし自分でできるなら、「とりあえずジノムワイド解析してみるか」となるかも、と思います。

    すみません、私もきちんとまとまっていません。

    谷内江さんのコメントには次に答えたいと思います。

  13. 守屋です

    いやぁ、なかなかいいコメントが引っ張りだせました。皆さんの熱意が感じられてうれしいです。自分の知りたい事がそこにあるならビッグプロジェクトなどもろともせずにぶつかっていく、その心意気ですね。

    吉田さんの意見もぜひ聞きたいです。

    ・・・ところでCharlie Booneは、ts-mutant、point-mutantも全部集めるというプロジェクトもやってませんでしたっけ?その合成致死もやるんじゃなかったかな。

  14. 谷内江さん、

    提案されたLoxP無しのalternative、確かにうまく動きそうです。

    ただ問題になるのが、5FOAの効率です。
    実感としてかなり効率が良いのはわかっているのですが、95%なのか99%なのか、それとも事実上100%なのか。
    さらに、96ウェルプレートで液体培養で実験することを想定していて、私は液体培地で5FOAがどれほど効率よく効くのか知らないので、不安がありました。谷内江さんならご存知でしょうか。

    合成致死になるべき二重変異株を想定すると、数%でもプラスミドを持った(=標的遺伝子が破壊されていない)細胞が残ると、そちらがどんどん増えて優勢になってしまうかと考えました。ダウンストリームのアッセイで常に5FOAを入れておくのも、コストや培地の互換性を考えると難しいかと。

    そこで、loxPでARSを切り出してやれば、仮にプラスミドを残したままの細胞が居ても、増殖できなくなるかと考えました。ついでにURA3もLoxPに挟んでおくことで、組み替えが失敗したプラスミド(URA3+)も5FOAで除けると考えました。

    こんな感じで、(2)へのお答えになりますでしょうか。

    ただ、どうせSceIで切ることも考えると、ちょっと余計な手間のような気もしてきました。
    どう思われますか?

    (1)ですが、プラスミドの挿入ではなく、配列の入れ替えによる破壊を行う場合、線状化しておくことで効率が向上すると認識しています。
    (4)ですが、確かにプラスミドを2つに分ける意味はありませんね。一つにまとめてしまいましょう。

  15. >大西さん

    私はlow-copy plasmid、液体5-FOA selectionをしたあと、SC-Ura plateにまいて、生えてきたことがありません。おそらく2micron plasmidを使いたい理由は、リニアカセットが沢山欲しいからということだと思いますが、high-copy plasmidでの5-FOA counter selectionの効率はわかりません。96-well plateでも心配ならpassageを何度か繰返せばいいかもしれませんが、time consumingですかね?プラズモダクションならCyhで同時にcounter selectionしてもいいかもしれませんね。

    リニアの方がいいんですね。ありがとうございます。

    >守屋さん

    tsコレクションは終わったと聞きました。これで致死遺伝子x致死遺伝子、致死遺伝子x非致死遺伝子のネットワークマッピングが終わったことになるそうです。非致死遺伝x非致死遺伝がまだまだ時間がかかるようです。point-mutationはわかりません。

  16. 谷内江さん、

    目の付けどころが素晴らしいですね。多核化した細胞にフェロモンを加えたら核融合が始まったりして…

    守屋さん、

    CharlieはtsのSGAもすでにやったはずです。一部はすでに論文になってるかもしれません。
    ゲノムワイドな網羅的スクリーニング(これは酵母SGAにかぎらずヒトRNAiスクリーニングなども含む)というのはパワフルで論理的にはとても有効なものですが確かに粗雑で再現性のとれないデータも多いように感じます。もちろん系がどんどんリファインされていることや情報の蓄積の恩恵は充分に理解しているつもりですし、系としての細胞を理解するためには網羅的解析が必須であることも承知しています。

    遺伝学者の端くれとして私はスクリーニングが大好きです。宝探しのロマンと興奮は他の実験とは一線を画すように思います。私の研究室でもいくつかスクリーニングを走らせているのですが(トロントのグループとSGAの応用でSDLスクリーニングもやりました)なんというか自分の手によるスクリーニングでとれてきた遺伝子のほうが愛着も強く、その後の解析にも自然に力が入ります。

    例えは悪いですがお見合いサイトでマッチした花嫁候補者数十人とお近づきになるよりも自分が偶然見初めた人を口説くほうがモチベーションがあがるといった感じでしょうか。研究者も人間ですから対象遺伝子への興味や愛情がブレークスルーへの一端になることもままあると思います。

    そういった意味ではトロントの大工場ではなく各研究室が自分の愛着のある遺伝子に対するSGAを自前でおこなうことができる大西メソッドは有力なツールになるかもしれませんね。

    実際のところSGA解析でなければ見つかってこなかった新規遺伝子機能や細胞機能はどのくらいあるのでしょうか?

  17. 吉田さん、

    MFA、MF(ALPHA)をGALプロモーターなどで誘導することはできそうですが、フェロモンの核融合への機序はわかっているのでしょうか?

  18. 谷内江さん、

    一連のKAR遺伝子群がとられてはいますがシグナル伝達は解っていないんじゃないかと思います。機能が解っているのも微小管の制御因子Kar9, キネシンKar3,SPB構成因子Kar1, BiP蛋白質Kar2くらいかな。

  19. 丑丸です。

    細胞分裂失敗=多核、このあと2核くらいまでは安定的に細胞にいられるという理解でよろしのですね。この現象の、他の菌類では見られる、同調した核分裂ということを行っているのでしょうが。分裂酵母的なバッドネックのくびれ(産道のようなイメージ)がない細胞では比較的、楽に核も別れそうですが、2核、4核になったら、同時、時間差、いずれにしても母細胞と娘細胞への核の分配はかなり難しいですね。

    時間差の場合には、一つの核が入ったところでmitotic exit networkが活性化して分裂終期が開始してしまい(母細胞にSPBが一つ残ることも重要なようですが)、他の核が入る前に細胞質分離とか起きてしまわないかと心配です。

    なんにせよ、多核を扱うようには元々できていないのですから、無理なことをやろうとしてもうまくいかないで、ご臨終というのは仕方ないことかもしれません。

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